Завод по производству крахмала: Оборудование для производства крахмала | Чувашский крахмальный завод |

состоят из высококонсервативного С-концевого каталитического домена и вариабельного N-концевого удлинения (рис.). Каталитический домен является консервативным между SS и бактериальными гликогенсинтазами, которые также используют АДФ-глюкозу в качестве субстрата, и содержит как домен GT5, так и домен GT1 (CAZy; [61]). Согласно кристаллической структуре Agrobacterium tumefaciens и E.coli гликогенсинтаз, GBSSI риса и SSI ячменя, каталитический домен принимает складку GT-B, с активным сайтом в щели между двумя доменами GT [62–65]. Связывание АДФ-глюкозы, вероятно, включает один или несколько консервативных мотивов Lys-X-Gly-Gly [66–68] и другие консервативные заряженные / полярные остатки [62, 69–72]. N-концевые расширения классов SS различны. В случае SSIII и SSIV эти удлинения, как было показано, участвуют во взаимодействиях белок-белок, потенциально посредством консервативных мотивов coiled-coil [73–75].N-концевая часть SSIII также содержит три консервативных углеводсвязывающих модуля (CBMs), которые участвуют в связывании субстрата [76, 77].

Доменная структура классов синтаз крахмала (SS). SS из Arabidopsis ( At ) по сравнению с гликоген-синтазами из E. coli ( Ec ) и почкующихся дрожжей ( Sc ). Кукуруза ( Zm ) SSIIIa и SSV включены, поскольку они отличаются по своей структуре от ортологов Arabidopsis. Показаны пластидные транзитные пептиды (N-концевые синие прямоугольники ), внутренние повторы ( серые прямоугольники , RPT), углеводно-связывающие модули семейства 25 ( желтые прямоугольники , CBM), домены спиральной спирали ( зеленые прямоугольники. , C), доменов гликозилтрансферазы-5 ( черных ящиков, , GT5), доменов гликозилтрансферазы-1 ( красных ящиков, , GT1) и домена гликозилтрансферазы-3 (, оранжевое поле, , GT3).Транзитные пептиды были предсказаны с помощью ChloroP [285], мотивы спиральной спирали с помощью Paircoil2 ([286]; значение p <0,05, минимальная длина 21 аминокислота) и всех других мотивов с помощью SMART. Обратите внимание, что длина домена и аннотация зависят от запрашиваемой базы данных. Например, домен GT3 Sc Gsy2P идентифицирован SMART как домен GT1 и здесь вручную переназначен как GT3 [287]. В то время как Sc Gsy2p является гликозилтрансферазой семейства GT3 и использует UDP-глюкозу в качестве субстрата, все другие показанные синтазы являются гликозилтрансферазами семейства GT5 и используют ADP-глюкозу в качестве субстрата.N-концевые области SSIII, содержащие мотивы спиральной спирали и CBM, высоко консервативны среди различных ортологов, но дополнительно содержат внутренние повторы в некоторых случаях (например, в SSIIIa ячменя и пшеницы). Ортологи SSII часто показывали более слабые предсказания спиральной катушки или их отсутствие. At SSV имеет слабо предсказанный транзитный пептид хлоропласта, но не имеет домена GT1 и его функция неизвестна. SSV из большинства других видов, однако, имеют С-концевое удлинение, включая участок, который был обозначен как предполагаемый GT1-подобный домен [60]. Bar 100 аминокислот (AA)

Дупликации генов привели к появлению нескольких изоформ некоторых ферментов. Кодируемые белки имеют высокую степень сходства последовательностей, но часто экспрессируются по-разному, при этом специфические изоформы преобладают в эндосперме или вегетативных тканях [78–84]. Например, для каждого класса SS в зерновых существует несколько изоформ (кроме SSI и SSV). Изоформы «а» SSII и SSIII, по-видимому, являются преобладающими изоформами в эндосперме на основании исследований экспрессии и мутантов (далее мы ссылаемся на эти «а» изоформы SSII и SSIII, если не указано иное).У других видов, включая Arabidopsis и растения, имеющие органы, заполненные запасом крахмала (например, картофель), существует только одна изоформа для каждого класса.

Гранулированная синтаза крахмала (GBSS) синтезирует амилозу.

Мутанты с пониженной активностью GBSS или без нее, так называемые восковые линии , как правило, производят меньше амилозы или вообще не продуцируют ее, соответственно, например, в эндоспермах кукурузы [85, 86 ], рис [87, 88], пшеница [89], ячмень [90] и амарант [91], корни маниоки [8], картофель [92, 93], семена гороха [94], листья арабидопсиса [95] и С.reinhardtii [96, 97]. Это говорит о том, что GBSS отвечает за синтез амилозы и что никакая другая синтаза не может заменить ее в этой функции.

Вероятно, что GBSS синтезирует амилозу в гранулированном матриксе, образованном амилопектином. Мониторинг распределения амилозы с течением времени в линиях картофеля, в которых экспрессия GBSS и содержание амилозы были подавлены до низких уровней, позволили предположить, что амилоза была более очевидной по направлению к центру гранулы крахмала и что это ядро, содержащее амилозу, растет вместе с гранулой [98 ].Важно понимать, что хотя и нерастворимы, гранулы гидратированы, и небольшие молекулы, такие как АДФ-глюкоза, очевидно, могут диффундировать в матрикс и использоваться связанными с гранулами белками [99]. Имеются доказательства in vitro, что GBSS действует скорее процессивно, чем распределительно, предпочтительно добавляя единицы глюкозы в одну и ту же цепь вместо переключения между цепями [68, 99]. Активность GBSS также сильно возрастает при анализе в концентрациях амилопектина, достаточно высоких для того, чтобы произошла спонтанная кристаллизация глюкана [68].Таким образом, GBSS может синтезировать амилозу, удлиняя отдельные цепи глюкана в среде, окружающей кристаллический или кристаллизующийся амилопектин. Его продукт, вероятно, хорошо защищен от ветвления, что объясняет, почему он в значительной степени линейен. Природа праймера, используемого для синтеза амилозы, полностью не выяснена. Радио-мечение гранул крахмала C. reinhardtii предполагает, что GBSS сначала удлиняет амилопектиновые цепи, а затем высвобождает эти цепи во фракцию амилозы [100].Однако у сосудистых растений это может быть иным, поскольку у Arabidopsis не наблюдалось переноса радиоактивной метки с амилопектина на амилозу [101]. Другим праймером могут быть мальтоолигосахариды, присутствие которых, как было показано, увеличивает активность GBSS и увеличивает его специфичность в отношении синтеза амилозы (в отличие от удлинения амилопектиновых цепей) как in vitro [102], так и in vivo [101].

Хотя GBSS почти полностью связан с гранулами [103], он не содержит каких-либо предполагаемых крахмал-связывающих доменов (рис.). Недавно было показано, что консервативный связывающий крахмал белок, снабженный CBM семейства 48 и длинным мотивом coiled-coil [104], взаимодействует с Arabidopsis GBSS через короткий мотив coiled-coil на GBSS [95]. Это взаимодействие было необходимо как для эффективного связывания GBSS с гранулами, так и для синтеза амилозы.

Данные свидетельствуют о том, что GBSS также способствует синтезу амилопектина. В некоторых исследованиях восковидных мутантов сообщалось, что структура амилопектина слегка изменена [91, 105–108], тогда как в других исследованиях — иногда на тех же видах — она ​​казалась нормальной [109–111].Заметным исключением является C. reinhardtii , где отсутствие GBSS вызвало изменение в структуре амилопектина: C. reinhardtii содержит низкомолекулярную фракцию амилопектина с характеристиками окрашивания йода, промежуточными между характеристиками амилопектина и амилозы, которые были отсутствует у мутантов GBSS [96]. Отличительная функция GBSS C. reinhardtii по сравнению с GBSS из сосудистых растений может быть объяснена наличием уникального C-концевого хвоста и многократной более высокой специфической активностью [112].Интересно, что двойной мутант C. reinhardtii , дефицитный по SSIII и GBSS, пострадал намного сильнее, чем каждый отдельный мутант, поскольку он продуцировал только небольшие количества в основном водорастворимого глюкана, который был почти лишен цепей с (DP выше 40 [97 , 113]. Также ранние работы по синтезу крахмала из клубней картофеля предоставили доказательства потенциальной роли GBSS в синтезе крахмала. В репрессорных линиях ssIII , в которых GBSS был активирован, амилопектин имел популяцию сверхдлинных цепей и крахмала. морфология гранул была изменена [114].Оба признака, вероятно, являются результатом (повышенной) активности GBSS, поскольку они были отменены, когда активность GBSS подавлялась одновременно с SSIII.

Основной синтез амилопектина: синтазы крахмала от SSI до SSIII

На основании мутантных фенотипов каждый класс SS, по-видимому, играет особую роль во время синтеза амилопектина: проще говоря, SSI и SSII, как полагают, образуют короткие цепочки, заполняющие один кластер (т. е. A- и B ₁ -цепи), в то время как SSIII предлагается для синтеза более длинных цепей B, охватывающих кластер [115].Напротив, SSIV, по-видимому, меньше участвует в определении структуры амилопектина, но выполняет функцию инициации крахмальных гранул и контроля морфологии гранул [116–118]. Однако в действительности ситуация более сложная: есть случаи функционального перекрытия между ферментами [119], нарушения биосинтеза ферментами, расщепляющими крахмал [120–122], и образования комплексов между ферментами [73, 74, 123–127] . Кроме того, существуют значительные пробелы в нашем фундаментальном понимании того, как каждый класс выполняет свою предполагаемую роль на молекулярном уровне, как описано в следующих разделах.

Относительный вклад каждого класса SS варьируется в разных тканях и между видами, что, как полагают, по крайней мере частично объясняет структурные различия между крахмалом из разных источников. В эндосперме кукурузы SSI и SSIII составляют основные очевидные активности растворимых SS [128], тогда как в листьях кукурузы транскрипт SSI не был обнаружен [129]. Напротив, SSII и SSIII являются основными очевидными растворимыми SS в семенах гороха и клубнях картофеля [130–132], тогда как транскрипты SSI картофеля почти исключительно обнаруживаются в листьях [133].В листьях Arabidopsis SSI является основным растворимым SS, о чем судят по остаточной активности SS одиночных мутантов ss , за которыми следуют SSIII и SSII [116, 134]. Несмотря на то, что он выражен на разумном уровне, SSIV, по-видимому, вносит лишь небольшой вклад в общую активность SS [116, 135]. Однако важно отметить, что оценки очевидного вклада SS могут быть смещенными; супрессия SSIII, например, часто сопровождается активацией SSI и / или GBSS, что означает, что сравнение активности общей синтазы в присутствии или в отсутствие SSIII не только отражает вклад SSIII.Кроме того, сами тесты SS могут предпочтительно измерять один класс по сравнению с другим, что приводит к ошибочным оценкам их относительной активности.

Крахмалосинтаза I (SSI)

Потеря активности SSI вызывает отчетливые изменения CLD амилопектина, особенно в отношении цепей A и B ₁ , составляющих кластеры. Амилопектин из эндоспермов мутантов ssI из риса (в сорте japonica , т.е. рис с неактивным SSIIa и протекающей мутацией в GBSS [136]) и супрессорных линий пшеницы [137] имеют более короткие цепи DP 6 и 7, меньшее количество цепочек DP 8–12 и больше цепочек примерно DP 18.Аналогичные изменения наблюдались и в крахмале листьев мутантов ssI Arabidopsis [122, 138]. Поразительно, что цепи, которые истощены у мутантов, имеют ту же длину, что и цепи, которые предпочтительно синтезируются с помощью SSI in vitro. Было показано, что SSI из кукурузы, фасоли и риса предпочитает короткие цепи (обычно DP <10) в качестве субстратов [136, 139, 140], а SSI из арабидопсиса более активен в отношении гликогена, чем амилопектина [138]. Эти находки указывают на то, что SSI удлиняет короткие цепи глюкана, происходящие из действия BE (которые в основном представляют собой DP 6), на несколько единиц глюкана (до DP примерно 8-10).Затем эти цепи, вероятно, дополнительно удлиняются SSII и, возможно, другими SS. Однако, поскольку у мутантов ssI и большинство цепей от действия BE все еще являются удлиненными, другие SS, по-видимому, лишь частично зависят от действия SSI.

Интересно, что цепи, удлиненные в отсутствие SSI, кажутся более удлиненными, увеличивая долю цепей вокруг DP 18 за счет более коротких цепей. При использовании модифицированных субстратов гликогена сообщалось, что активность усеченного на N-конце SSI кукурузы резко снижается с увеличением длины внешней цепи, в то время как его связывание с субстратом сильно увеличивается [139].Авторы предложили сценарий, в котором эти характеристики заставят SSI придерживаться удлиненных глюкановых цепей в качестве неактивного фермента, тем самым предотвращая удлинение за счет других синтаз. В самом деле, захват SSI внутри гранулы до некоторой степени обычно наблюдается [128, 136, 140, 141]. Неясно, действительно ли степень связывания SSI с гранулами достаточна для блокирования значительной части его короткоцепочечных продуктов. Более того, другие данные свидетельствуют о том, что локализация SSI в гранулах зависит от связывания крахмала его партнера по взаимодействию, SSII (см. Ниже).

Более поздние данные in vitro показали, что рекомбинантный SSI арабидопсиса может фактически синтезировать цепи до DP 15 при инкубации с мальтогептаозой в качестве праймера [142] и, при содействии BE, был способен продуцировать весь спектр длин цепей, обычно присутствующих в один кристаллический слой амилопектина (т.е. цепи A и B ₁ [143]). Укороченная на N-конце версия SSI ячменя даже давала цепи DP> 40 при использовании мальтогексозы в качестве праймера [144]. Таким образом, настоящая причина, по которой некоторые короткие цепи, генерируемые SSI, не удлиняются дальше в условиях дикого типа, остается неясной.

Arabidopsis SSI является редокс-чувствительным и требует восстановительных условий для активности [145]. В соответствии с кристаллической структурой SSI ячменя было высказано предположение, что между цистеинами 126 и 506 может образовываться дисульфидный мостик, блокирующий активный центр [65]. Однако одиночная мутация каждого из этих остатков цистеина не делала SSI полностью редокс-нечувствительным, и мутантный белок C506S терял большую часть своей активности.

Крахмалосинтаза II (SSII)

Эффекты дефицита SSII были охарактеризованы для клубней картофеля [133, 146–148], семян гороха [149], эндосперма пшеницы [150], ячменя [151], риса ( я.е., сорт риса japonica [152, 153]) и кукурузы [154] и в листьях Arabidopsis [119, 122, 134]. Наблюдаемые фенотипы удивительно похожи и включают отчетливое изменение тонкой структуры амилопектина: наблюдается повышенное количество цепей вокруг DP 8 и сниженное количество цепей вокруг DP 18, то есть сдвиг в сторону более коротких цепей. Кроме того, мутантные крахмалы ssII часто имеют больше амилозы, измененную морфологию гранул и пониженную кристалличность крахмала. У арабидопсиса также сообщалось, что вместе с крахмалом накапливаются небольшие количества растворимого глюкана [122].

Основываясь на изменениях в CLD, кажется, что SSII удлиняет цепи примерно DP 8 (цепи, удлиненные SSI) до длины около DP 18. Эта прямая интерпретация осложняется тем фактом, что, по крайней мере, в зерновых, SSII взаимодействует с SSI и БЭ класса II (см. Раздел «Роль комплексообразования и фосфорилирования ферментов биосинтеза крахмала»). Следовательно, потеря SSII может иметь плейотропные эффекты на эти ферменты, что затрудняет оценку того, какая часть фенотипа напрямую связана с отсутствием активности SSII.Например, умеренное увеличение амилозы у мутантов ssII может быть вызвано измененной активностью BEII (см. Раздел «Специфика классов BE»). Однако вполне вероятно, что изменения тонкой структуры амилопектина вызваны отсутствием активности SSII. Во-первых, когда рекомбинантный SSII риса инкубировали с амилопектином из мутанта ssII риса , он специфически удлинял аберрантно короткие цепи, так что теперь модифицированный глюкан выглядел более похожим на дикого типа [155]. Во-вторых, потеря активности SSI на фоне мутанта ssII вызвала типичные изменения ssI , что указывает на то, что SSI все еще активен [122, 134, 136].В-третьих, изменения в амилопектине CLD аналогичны у двудольных растений, где нет доказательств образования SSII-содержащих комплексов.

Крахмалосинтаза III (SSIII)

По сравнению с SSI и SSII функция SSIII менее ясна. Его предполагаемые функции включают синтез длинных В-цепей, удлинение цепей, заполняющих кластер (частично дублирующая функция с SSII) и регулирование других ферментов биосинтеза крахмала. Кроме того, SSIII важен для инициации гранул крахмала, по крайней мере, в отсутствие SSIV.В соответствии с мнением о универсальной роли SSIII проявляется как основная активность растворимых SS во всех растениях и тканях, которые были проанализированы на сегодняшний день. Он также несет самое длинное N-концевое удлинение среди всех SS, которое несет домены связывания крахмала и предсказанные домены coiled-coil (Fig.).

Вероятно, наиболее хорошо охарактеризованная функция SSIII заключается в синтезе длинных, охватывающих кластеры B-цепей (например, B ₂ , B ₃ и т. Д.). Меньшее количество таких цепей наблюдалось у ssIII мутантных крахмалов из клубней картофеля [148], эндоспермов кукурузы [109, 156] и риса [157], а также у C.reinhardtii [97]. Из охарактеризованных мутантов ssIII только мутант Arabidopsis ssIII [158] и мутант ячменя amo1 не проявляют этого фенотипа (обратите внимание, что мутация amo1 не отменяет активность SSIII [159]). .

Изменения профиля короткой цепи амилопектина от мутантов ssIII [147, 148, 157, 158, 160] указывают на то, что SSIII также участвует в синтезе коротких цепей A и B. Эти изменения незначительны по сравнению с изменениями, вызванными отсутствием SSI или SSII.В отсутствие SSII, однако, дополнительная потеря SSIII значительно усиливает мутантный фенотип в зернах риса [80], клубнях картофеля [147, 148] и листьях Arabidopsis [119], подтверждая частично повторяющиеся функции между этими двумя SS. Двойной мутант ssII / ssIII Arabidopsis продуцировал крошечные количества глюканов с резко укороченными цепями, часть которых была растворима в воде [119, 122]. В клубнях картофеля комбинированная репрессия SSII, SSIII и GBSS привела к получению крахмала без амилозы с короткоцепочечным амилопектином, гели которого не подвергались ретроградации при повторных циклах замораживания-оттаивания — предпочтительная характеристика для пищевой промышленности [161].

Мутанты Arabidopsis ssIII , как сообщалось, обладают повышенной общей активностью растворимого SS [158] и производят больше крахмала в течение дня [117, 158] в листе, что позволяет предположить, что он имеет отрицательную регуляторную функцию в отношении других крахмалов. -биосинтетические ферменты. Однако в других исследованиях сообщалось о незначительном снижении активности растворимых СС [117, 134] и уровней крахмала [122, 134]. Увеличение уровней SSI и / или GBSS наблюдалось в эндоспермах ssIII, кукурузы [128] и риса [157], а также у C.reinhardtii [97]. Поэтому возможно, что некоторые изменения в тонкой структуре амилопектина вызваны повышенными уровнями SSI. Более того, наблюдаемое увеличение содержания амилозы в крахмале ssIII из кукурузы [156, 162] и риса [111, 157] может быть связано с повышенной активностью GBSS. Повышенное действие GBSS также может быть причиной других фенотипов, связанных с дефицитом SSIII, таких как увеличенное количество сверхдлинных амилопектиновых цепей и трещинных гранул [114, 157]; репрессия GBSS в дополнение к SSIII в клубнях картофеля подавляла эти аспекты фенотипа ssIII [114].

Инициирование образования крахмальных гранул: синтаза крахмала IV (SSIV) и другие факторы

На сегодняшний день мутанты с пониженной активностью SSIV описаны только у риса [80, 163] и арабидопсиса [116–118]. У риса есть две изоформы SSIV: Os, SSIVa, которая слабо экспрессируется в листьях и эндосперме, и Os, SSIVb, которая обычно экспрессируется выше [79, 80]. Ни одиночные репрессоры Os, SSIVa или Os, SSIVb [80], ни нулевые мутанты Os SSIVb (у сорта japonica ; [163]) не обнаруживают заметных изменений в содержании или структуре крахмала в эндосперме семян.Напротив, нулевые мутанты единственной изоформы SSIV у Arabidopsis демонстрируют изменения суточного содержания крахмала в листьях, имея меньше крахмала в конце дня и больше в конце ночи по сравнению с растениями дикого типа, несмотря на то, что у них нормальный мелкий амилопектин. структура [116]. Мутант ssIV Arabidopsis также имеет заметные изменения в количестве и форме гранул крахмала: вместо примерно шести дискоидных гранул [164] хлоропласты мутантов ssIV имеют ноль, одну или две гранулы, которые увеличены и имеют сферическую форму. менее электронно-плотный центр [116, 118].В молодых листьях ssIV хлоропласты не содержали крахмала [118]. Сверхэкспрессия At SSIV у Arabidopsis увеличивала общее содержание крахмала в листьях, хотя об увеличении количества крахмальных гранул не сообщалось [165].

В целом, Arabidopsis SSIV явно выполняет уникальную функцию в отношении инициации и морфологии крахмальных гранул, а также степени накопления крахмала [116, 118]. Интересно, что уровни АДФ-глюкозы (субстрат для SS) у мутантов ssIV увеличены более чем в 50 раз, что позволяет предположить, что ее потребление сильно ограничено [118].Это особенно вероятно в случае хлоропластов без крахмала, где оставшиеся изоформы SS не имеют субстрата глюкана. Напротив, растения Arabidopsis, имеющие SSIV в качестве единственного растворимого SS (т. Е. мутантов ssI / ssII / ssIII ), продуцируют такое же количество гранул на хлоропласт, что и растения дикого типа, несмотря на то, что в целом они имеют лишь небольшое количество аберрантного крахмала [117]. Было бы интересно посмотреть, есть ли аналогичные воздействия на крахмал листа в мутантных и репрессорных линиях риса ssIVb .

Анализы нескольких мутантов SS у Arabidopsis показывают, что SSIII (но не SSI и SSII) требуется для достижения некоторого синтеза крахмала в отсутствие SSIV: мутанты Arabidopsis ssIII / ssIV почти полностью не способны синтезировать крахмал и проявляют хлороз и задержку роста. рост [37, 117].Несмотря на сильно сниженную скорость фотосинтеза, эти мутанты по-прежнему накапливают примерно в 100 раз больше АДФ-глюкозы, нарушая баланс аденилатного пула и, возможно, объясняя наблюдаемые плейотропные дефекты [37]. Последствия потери SSIIIa и SSIVb в рисе japonica были совершенно иными, хотя все же поразительными. Двойной мутант ssIIIa / ssIVb все еще был способен продуцировать значительные количества крахмала эндосперма, но накапливал сферические и рыхлые гранулы вместо обычно наблюдаемых полиэдрических гранул сложного типа [163].Этот фенотип сопровождался неровной поверхностью амилопласта и измененным галактолипидным составом мембран. Изменения в последнем ранее были вовлечены в переход от гранул простого к сложному типу у мутанта кукурузы opaque5 [166]. Toyosawa и его коллеги предположили, что SSIVb может быть важен для структурной целостности пока еще не охарактеризованных мембраносодержащих структур, подобных перегородке [163], которые могут формировать плесень внутри амилопластов для придания крахмалу многогранной формы [167].Возможные причины фенотипических различий между рисом ssIIIa / ssIVb и ssIII / ssIV Arabidopsis включают присутствие других изоформ SSIII и SSIV в эндосперме риса и / или механистические различия в хранении и переходном образовании крахмальных гранул.

Функция SSIV и механизмы определения количества и формы гранул остаются загадочными. Биосинтез гликогена у других организмов начинается с самогликозилирования либо гликогенсинтаз (в бактериях; [168]), либо специализированных белков, называемых гликогенинами (в эукариотических клетках; [169, 170]).Введение самопрайминга гликогенсинтазы A. tumefaciens в двойные мутанты Arabidopsis ssIII / ssIV действительно восстановило инициацию множественных крахмальных гранул на хлоропласт, но морфология гранул оставалась такой же, как у ssIV [118]. Попытки подтвердить такую ​​самопрайминговую активность в рекомбинантном At SSIV (и At SSIII) не увенчались успехом [117], хотя было обнаружено, что At SSIII катализирует образование непраймированного глюкана в присутствии АДФ-глюкозы [117].Функция автоглюкозилирования может не потребоваться для объяснения инициации полимеров крахмала в фотоавтотрофных тканях, если идеи о синтезе мальтозы de novo во время фотосинтеза подтвердятся [171, 172]: все четыре растворимых SS из Arabidopsis способны удлинять мальтозу и дольше. мальтоолигосахариды (но не глюкоза) [142].

Arabidopsis SSIV, как сообщается, взаимодействует с двумя белками, ассоциированными с пластоглобулами, фибриллинами FBN1a и FBN1b [75]. Это взаимодействие зависело от присутствия некаталитического N-конца SSIV, предположительно содержащего мотивы спиральной спирали (рис.). Исследования локализации SSIV показывают, что это стромальный белок, слабо нацеленный на отдельные точки внутри хлоропласта — первоначально предполагалось, что это края гранул [117]. Однако совсем недавно сообщалось, что он связан с тилакоидными мембранами [75]. В эндосперме риса SSIVb также имел субпластидную локализацию, преимущественно распределяясь в пространстве между гранулами крахмала, хотя отдельные пятна наблюдались редко [163]. Учитывая его предполагаемую роль в определении количества и морфологии гранул, специфическое расположение SSIV в пластиде вполне может оказаться решающим фактором.В свою очередь, понимание факторов, влияющих на его локализацию — в гранулах или мембранах — может дать совершенно новое понимание контроля образования крахмала.

Дополнительные факторы участвовали в контроле количества гранул крахмала. Ряд белков, которые самоглюкозилируются с использованием UDP-глюкозы, были описаны на протяжении многих лет (например, [173–175]), но ни один из них не имел сигналов нацеливания на пластид, но в основном участвовал в биосинтезе клеточной стенки [176]. О белках, гомологичных гликогенинам, сообщалось у Arabidopsis, и подавление белка, содержащего предсказанный сигнал нацеливания на хлоропласты, по-видимому, уменьшало накопление крахмала [177].Это наблюдение, основанное на окрашивании йодом, не было подтверждено. Интересно, что мутантные фенотипы также предполагают участие α-глюканфосфорилазы и DBE изоамилазы как влияющих на количество гранул крахмала (описано в последующих разделах). Также интересно отметить, что один из белков, участвующих в обратимом фосфорилировании глюкана, избыток крахмала 4 (SEX4), активность которого требуется для разложения крахмала в ночное время, также оказывает сильное влияние на морфологию крахмальных гранул, поскольку его потеря приводит к очень сильному разложению крахмала. крупные круглые гранулы [26].Об этом фенотипе не сообщалось для других мутантов, затронутых деградацией крахмала, и его основа еще не исследована.

Классы и доменная структура ферментов ветвления (BE)

Ферменты разветвления крахмала (EC 2.4.1.18) принадлежат к суперсемейству ферментов α-амилазы (также называемого семейством гликозидгидролаз 13; CAZy: [59]; недавно рассмотрено [ 178]. Они расщепляют цепь α-1,4-глюкана и переносят отщепленную часть в положение C6 единицы глюкозы из той же или другой цепи, создавая ответвление, связанное с α-1,6.При этом BE генерируют дополнительные субстраты для SS (то есть невосстанавливающие концы цепей). BE имеют общую трехдоменную структуру: N-концевой домен, содержащий CBM семейства 48, центральный каталитический домен α-амилазы, характерный для членов семейства Gh23, и C-концевой домен, присутствующий в некоторых α-амилазах (рис.).

Доменная структура ферментов ветвления (BE). Классы BE можно различать по последовательности, но имеют общую доменную структуру. Изображены пластидные транзитные пептиды (N-концевые , синие прямоугольники ), углеводсвязывающие модули семейства 48 ( оранжевые прямоугольники, , CBM), каталитические домены семейства α-амилазы (, черные прямоугольники, , AMY) и все-β домены, обычно обнаруживаемые на С-конце членов семейства α-амилаз (, синие прямоугольники, , AMY_C).Прогнозы доменов были получены, как показано на рис. Домены coiled-coil не были предсказаны с настройками, описанными на рис. Структура домена сохраняется между классами и ортологами, хотя длина предсказанного каталитического домена семейства α-амилазы варьировала. Поскольку арабидопсис не имеет класса I BE, для сравнения включен BEI кукурузы ( Zm BEI), а также BE гликогена из почкующихся дрожжей ( Sc Glc3p) и E. coli ( Ec GlgB). At BE1 — это предполагаемый BE класса III, в котором отсутствует CBM48, и еще не было показано, что он демонстрирует активность ветвления. Bar 100 аминокислот (AA)

В соответствии с сходством последовательностей BE разделяются на ферменты класса I (или семейство B) и класса II (семейство A). Ферменты класса I обычно встречаются в виде единой изоформы у planta, за исключением Arabidopsis, который не содержит BE класса I [179]. Класс II представлен одним геном у картофеля и гороха, но две изоформы — BEIIa и BEIIb — встречаются в злаках. Они имеют различные паттерны экспрессии: в кукурузе, рисе и ячмене экспрессия BEIIb ограничена зерном, тогда как BEIIa обнаруживается во всех тканях, но часто на более низких уровнях [180–183].Arabidopsis также имеет два БЭ типа II (ВЕ2 и ВЕ3), оба из которых экспрессируются в листьях и кажутся в значительной степени функционально избыточными [179].

Гомология белковых последовательностей выявила предполагаемый третий класс БЭ. Гены, принадлежащие к этому классу III, были обнаружены у Arabidopsis (BE1; [179]), риса, тополя и кукурузы (BEIII; [78, 184]. Несмотря на высокую гомологию внутри этого класса (около 60%), белки разделяют только около 30% идентичности с БЭ из класса I и II [184]. На сегодняшний день функциональный анализ этого предполагаемого БЭ был проведен только на Arabidopsis, где сначала сообщалось, что нокаут-мутанты имеют фенотип дикого типа [179], а затем должны быть неприкосновенный [185].Ни одна из групп не сообщала об активности ветвления. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы выявить каталитическую активность и биологическую функцию этих белков.

Специфические классы ферментов ветвления (BE)

Считается, что конкретное размещение ветвей BE является основным фактором, определяющим кластерную структуру крахмала (то есть обогащение ветвей в определенных, регулярно расположенных областях). Однако из-за наших ограничений в оценке фактического распределения точек ветвления, исследования специфичности изоформ BE часто больше фокусировались на длине перенесенных цепей, а не на их размещении, в первую очередь путем сравнения CLD глюканов до и после модификации in vitro. пользователя BE.Соответственно, BE класса I имеют тенденцию переносить несколько более длинные цепи, чем BEII, и более активны по отношению к амилозе, тогда как BE класса II обычно предпочитают амилопектин [186–190]. Кроме того, BEI из риса модифицировал амилопектин, ограничивающий фосфорилазу, что позволяет предположить, что этот BEI может переносить уже разветвленные цепи [190, 191]. Получение ограничивающих фосфорилазу CLD после воздействия БЭ позволяет также анализировать модификации внутренних структур ветвления [191]. Это показало, что все рисовые БЭ производят относительно широкое распределение расстояний между новыми и старыми ветвями [191].Напротив, гликоген BE из E. coli ( Ec GlgB), передавая цепи аналогичной длины растительным BEII, отличался тем, что он предпочтительно помещал новые ветви всего в трех единицах глюкозы от существующей точки ветвления [191] . Этот структурный признак также наблюдался, когда Ec, GlgB экспрессировался в линии Arabidopsis, дефицитной по своим эндогенным БЭ (двойные мутанты be2 / be3 ) [192]. Тем не менее, Ec GlgB восстанавливали синтез нерастворимых глюканов [192, 193], хотя и в уменьшенных количествах и в виде частиц неправильной формы.

Мутанты BEI были проанализированы в эндоспермах кукурузы [194, 195], риса [6, 196] и пшеницы [197], а ген репрессирован в клубнях картофеля [198]. Во всех случаях делеция или уменьшение BEI приводило только к незначительным изменениям в структуре / количестве крахмала в лучшем случае, так что его функция in vivo остается неясной. Снижение большей части или всей активности BEII, однако, вызывало заметные изменения в крахмале и хорошо известном фенотипе амилоза — удлинитель ( ae ). Этот фенотип наблюдался у мутантов beIIb кукурузы [199] и риса [200], у мутантов beIIa твердой пшеницы [201], у мутантов BEII у гороха (давая мутанты с морщинистыми семенами, исследованные Грегором Менделем [ 202, 203]) и в линиях двойных репрессоров BEIIa и BEIIb пшеницы и ячменя [204, 205].Фенотип ae характеризуется измененной структурой амилопектина с более длинными внешними и внутренними цепями и, в некоторых случаях, повышенным уровнем амилозы [6, 106, 202, 206–208]. Благодаря своим особым свойствам набухания и желатинизации, а также пониженной перевариваемости в пищеварительном тракте крахмал ae представляет особый интерес как для промышленности, так и для здоровья человека [11, 30]. В зернах риса уровни экспрессии BEIIb коррелировали со структурой амилопектина, а усиление репрессии BEIIb сопровождалось сменой полиморфа A на C и на полиморф B [207, 209].При сверхэкспрессии BEIIb наблюдались глюканы с более низкой кристалличностью, чем обычно, а также накапливались растворимые глюканы [209].

В клубнях картофеля репрессия BEII привела к амилопектину с более длинными цепями [210], но высокое содержание амилозы наблюдалось только при подавлении генов BE как I, так и II класса [211]. Этот крахмал с высоким содержанием амилозы также имел высокий уровень фосфатов — еще одна особенность, представляющая значительный промышленный интерес. Однако общий выход крахмала сильно снизился [211]. Недавно сообщалось, что сверхэкспрессия BEII в картофеле увеличивает количество коротких амилопектиновых цепей (в основном DP 6), снижает температуру желатинизации крахмала и снижает содержание фосфатов [212].

Некоторые мутации в BE влияют на метаболизм крахмала в листьях. Мутанты кукурузы beIIa имеют нормальный крахмал эндосперма, но в основном заменяют крахмал листа глюканом с низкой молекулярной массой и низкой степенью разветвления [213, 214]. Хотя BEIIa является преобладающим БЭ в листьях кукурузы, транскрипты БЭИ были также обнаружены в листе [214], предположительно отвечающие за остаточный синтез глюкана. У Arabidopsis мутанты, разрушенные в обоих БЭ класса II (ВЕ2 и ВЕ3), демонстрируют полную потерю активности БЭ и не способны продуцировать крахмал.Вместо этого они накапливают большое количество мальтозы [179]. Было высказано предположение, что этот водорастворимый глюкан образуется во время одновременного синтеза линейных цепей SS и деградации пластидальной α-амилазой 3 (AMY3) и / или β-амилазами.

В совокупности многочисленные исследования BE показывают, что, как и ожидалось, активность ветвления абсолютно необходима для синтеза амилопектина. Они также показывают, что специфические особенности БЭ различаются и что они значительно влияют на окончательную структуру глюкана.Более того, их активность по сравнению с SSs важна, что иллюстрируется изменением структуры глюкана при экспрессии в разной степени [209, 212]. Тем не менее, BE не являются единственными детерминантами для синтеза компетентных для кристаллизации глюканов, что демонстрируется способностью E. coli гликогена BE восстанавливать синтез некоторых нерастворимых глюканов [192, 193]. Следует также иметь в виду, что БЭ образуют комплексы с другими ферментами биосинтеза крахмала, которые могут влиять на их функции (описанные ниже).

Ферменты разветвления (DBE) и обрезка глюканов

DBE растений гидролизуют α-1,6-связи и высвобождают линейные цепи. Они принадлежат к семейству гликозилгидролаз 13 (CAZy: [59]) и разделяют центральный домен α-амилазы и домен связывания крахмала с BE (рис.,). Далее их можно разделить на два типа: изоамилазы (ISA; E.C. 3.2.1.68) и лимит-декстриназа (LDA; E.C. 3.2.1.41). Эти два типа можно различить по белковым последовательностям и субстратной специфичности, поскольку только LDA могут эффективно разлагать пуллулан [215, 216], дрожжевой глюкан, состоящий из α-1,6-связанных мальтотриозильных единиц (отсюда альтернативное название фермента пуллуланаза или ПУ1).Геномы растений кодируют три класса изоамилазы — ISA1, ISA2 и ISA3 — и один LDA.

Доменная структура ферментов разветвления. Ферменты разветвления Arabidopsis ( At ISA1, At ISA2, At ISA3, At LDA) и фермент разветвления E. coli ( Ec, GlgX) разделяют доменную структуру с BE. Фермент непрямого разветвления почкующихся дрожжей ( Sc Gdb1p) показан для сравнения. Изображены пластидные транзитные пептиды (N-концевой , синие прямоугольники ), углеводсвязывающие модули семейства 48 ( оранжевые прямоугольники, , CBM), каталитические домены семейства α-амилазы (, черные прямоугольники, , AMY) и домен Pfam. неизвестной функции, DUF3372 ( красный ящик , DUF).Прогнозы доменов были получены, как показано на рис. Домены coiled-coil не были предсказаны с настройками, описанными на рис. Там, где можно было получить полноразмерные последовательности, доменные структуры классов сохранялись среди ортологов у различных видов. Sc Gdb1p содержит три домена фермента, расщепляющего ответвления гликогена (GDE) Pfam (hGDE_N, hGDE_central и GDE_C, от N до C конца). Это характерно для эукариотических GDE, которые объединяют олиго-α-1,4 → α-1,4-глюканотрансферазу (EC 2.4.1.25) и α-1,6-глюкозидаза (EC 3.2.1.33) в рамках одного фермента и обезвоживания гликогена в двухступенчатом механизме. Bar 100 аминокислот (AA)

ISA1 и ISA2 участвуют в разветвлении во время синтеза амилопектина и, таким образом, находятся в центре внимания. Они действуют вместе как гетеромультимерный фермент, и ISA1 дополнительно образует активные гомомультимеры у некоторых видов (описанных ниже) — в дальнейшем мы используем «ISA» для обозначения как гомомерной, так и гетеромерной активности. Напротив, ISA3 и LDA в первую очередь разветвляют крахмал во время его деградации, и мутанты этих ферментов часто имеют крахмала — избыток ( пол ) фенотипов [217–220].Тем не менее, ISA3 и LDA действительно влияют на глюкан, вырабатываемый в отсутствие ISA, хотя они не могут заменить его специфическую функцию [121, 218, 221–223].

Мутанты без ISA частично замещают крахмал водорастворимым полисахаридом в эндоспермах кукурузы [224, 225], риса [226] и ячменя [227], в клубнях картофеля [228], листьях арабидопсиса [120, 218] и у C. reinhardtii [229]. С точки зрения уровня разветвления, длины волны максимального поглощения после окрашивания лица с йодом и молекулярной массы этот водорастворимый глюкан напоминает гликоген и, следовательно, был назван фитогликогеном [230].В большинстве случаев все же производится нерастворимый крахмал, хотя и с небольшими структурными изменениями. Только у C. reinhardtii и japonica риса (т.е. риса с фоном ssII ) мутанты isa1 полностью не способны продуцировать крахмал [226, 229]; во втором случае это зависит от мутировавшего аллеля ssII [231].

Распространенной моделью, объясняющей накопление фитогликогена, является модель «обрезки» [232]. Согласно этой модели, ISA удаляет лишние ответвления из вновь созданной аморфной зоны в «пре-амилопектине», так что только соответствующие цепи удлиняются SS.В отсутствие ISA большое количество разветвлений привело бы к стерическим ограничениям, отмене регулярных структур и синтезу дополнительных ламелей. В соответствии с этим фитогликоген Arabidopsis действительно обогащен ветвями, разделенными небольшими расстояниями [120]. Однако, в то время как эта модель рассматривает разветвление с помощью ISA как обязательный этап, тщательное наблюдение за мутантами, не имеющими фермента, позволяет предположить, что это не является строго необходимым для получения пригодного для кристаллизации глюкана: не только большинство мутантов с дефицитом ISA вырабатывают некоторое количество крахмала, часто и то, и другое. крахмал и фитогликоген производятся в одной и той же пластиде, и некоторые типы клеток / ткани оказываются мало затронутыми (например,грамм. пучково-влагалищные клетки из листьев Arabidopsis и кукурузы [120, 233, 234]). Streb et al. показали, что крахмал листьев арабидопсиса полностью замещен фитогликогеном у мутанта isa1 / isa2 / isa3 / lda , лишенного всех DBE [121]. Это предполагает некоторое функциональное перекрытие между DBE — результат, согласующийся с предыдущими наблюдениями на арабидопсисе [218, 223], кукурузе [217] и рисе [221, 222]. Однако дополнительная мутация ферментов деградации крахмала α-амилазы 3 (AMY3) на фоне мутантного разветвления частично восстанавливает синтез гранул крахмала, показывая, что разветвление, хотя и является частью процесса биосинтеза, не является абсолютным требованием [121].Этот результат согласуется с более ранним наблюдением, что фитогликоген склонен к разрушению ферментов [120], и предполагает, что модификации, производимые деградирующими ферментами, также служат для предотвращения образования нерастворимых гранул крахмала на образующихся молекулах. Недавно генетический анализ арабидопсиса [122] и риса [231] показал, что длина цепей, заполняющих кластер, также влияет на то, образуются ли нерастворимые глюканы в отсутствие ISA; относительное увеличение длинных цепей способствует образованию нерастворимых глюканов, тогда как обогащение более коротких цепей полностью их устраняет.Например, двойные мутанты ssI / isa имеют более длинные цепи A и B ₁ и продуцируют значительно больше крахмала, чем одиночные мутанты isa [122] (рис.). Таким образом, кажется, что расщепление ответвлений облегчает или ускоряет кристаллизацию глюканов, а не формально делает это возможным. Сама кристаллизация в твердых гранулах может, в свою очередь, защитить глюканы от преждевременной деградации амилазами [120, 121].

Модуляция мутантного фенотипа isa с помощью синтаз крахмала.Просвечивающие электронные микрофотографии хлоропластов арабидопсиса в конце дня. Растения дикого типа (WT) содержат гранулы крахмала ( черных стрелок, ) в мезофилле и эпидермисе. Мутант isa1 / isa2 накапливает преимущественно фитогликоген ( белые стрелки, ) в мезофилле, но все же производит крахмал в эпидермальных клетках. Дополнительная потеря SSI восстанавливает образование гранул крахмала в мезофилле, скорее всего, из-за относительного увеличения доли более длинных, заполняющих кластеры цепей, которые способствуют кристаллизации, несмотря на аберрантное разветвление.Напротив, дополнительная потеря SSII полностью отменяет синтез нерастворимых глюканов даже в эпидермальных клетках. Вероятно, это происходит из-за относительного увеличения более коротких цепей в отсутствие SSII, нарушая образование вторичных и третичных структур. Epi эпидермальная клетка, Pal палисадная клетка, Bars 1 мкм. Адаптировано из [122], Авторское право Американского общества биологов растений (http://www.plantphysiol.org)

Интересно, что недавние исследования показывают, что сама ISA может действовать разрушающим образом при некоторых обстоятельствах.Во-первых, экспрессия At ISA1– At ISA2 в E. coli [235] и S. cerevisiae (BP и SCZ, неопубликованные данные) препятствовала накоплению гликогена вместо образования более амилопектин-подобного глюкана. . Во-вторых, гораздо меньше глюканов обнаружено у двойного мутанта ssII / ssIII Arabidopsis по сравнению с тройным мутантом ssII / ssIII / isa [122]. Примечательно, что глюканы, полученные из растений ssII / ssIII , показали структурное сходство с гликогеном в том, что они имели гораздо более короткие цепи, чем амилопектин дикого типа, и частично были обнаружены в водорастворимой фракции [122].Эти данные показывают, что разветвление под действием ISA для ускорения кристаллизации требует соответствующего глюканового субстрата — преамилопектина с адекватной длиной цепи и / или паттерном разветвления. Если структура глюкана несовместима с (быстрой) кристаллизацией при расщеплении ветвей (например, из-за недостаточно длинных цепей), постоянная доступность может вызвать избыточное расщепление разветвлений и, в конечном итоге, деградацию глюкана.

Чисто разрушающее действие ISA может также объяснить образование множества мелких гранул / частиц у мутантов isa [227, 228, 236].Предполагается, что у Arabidopsis этот фенотип является вторичным эффектом, возникающим в результате усиленного α- и β-амилолитического разложения растворимых глюканов: это может давать небольшие растворимые олигосахариды, которые могут служить праймерами для синтеза глюкана или сайтами зародышеобразования для гранул крахмала [ 121]. Однако небольшие разветвленные олигосахариды, возможно, представляющие собой самую раннюю стадию нормального синтеза глюкана, также могут быть отличными мишенями для разветвления под действием ISA, как упоминалось выше. Удаление ветвей и удаление таких глюканов может ограничить пул потенциальных центров зародышеобразования для гранул крахмала.

Определенные функции гомо- и гетеромультимеров изоамилазы

В зависимости от вида, ISA1 действует либо исключительно в гетеромультимерных комплексах, образованных между ISA1 и ISA2, либо как гетеромерные, так и гомомерные комплексы. Мутанты Arabidopsis isa1 , isa2 и isa1 / isa2 обнаруживают идентичные фенотипы [120]. Более того, At ISA1 и At ISA2 имеют высокую нативную молекулярную массу, взаимодействуют друг с другом и стабильны только в присутствии своего партнера [120, 235].Каталитическая активность наблюдалась только тогда, когда присутствовали как At, ISA1, так и At ISA2 [235, 237]. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что ISA1 и ISA2 образуют облигатный гетеромультимерный фермент. ISA2 несет в себе замены в аминокислотных остатках, важных для катализа, что, вероятно, делает его некаталитическим. Следовательно, ISA1, вероятно, будет каталитической субъединицей, при этом ISA2 требуется для стабильности фермента и, возможно, для его специфичности и / или регуляторных свойств [235, 238, 239].Точно так же у картофеля был обнаружен только гетеромультимерный комплекс ISA1 и ISA2 [240], хотя ISA1 картофеля был активен сам по себе, когда рекомбинантно экспрессировался как S-tagged белок в E. coli [238].

У других видов очевидно, что ISA1 также действует как гомомультимер. Один или несколько гомомерных комплексов ISA1 были обнаружены в дополнение по крайней мере к одному комплексу ISA1 / ISA2 в зернах риса и кукурузы и в C. reinhardtii [240–242]. В недавней кристаллической структуре C.reinhardtii ISA1 имеет удлиненную структуру и спарен с др. ISA1 хвостом к хвосту, хотя нельзя исключать существование высших мультимеров [242]. Мутанты кукурузы и риса isa2 , которые имеют только гомомер ISA1, обладают таким же синтезом крахмала эндосперма, что и растения дикого типа, предполагая, что гомомеров ISA1 достаточно [241, 243]. Однако на фоне мутанта ssIII потеря ISA2 привела к накоплению фитогликогена в зернах кукурузы [160] — интригующее, хотя и необъяснимое наблюдение.Также сообщалось, что гетеромультимер ISA1 / ISA2 является более термостабильным и имеет более высокое сродство к фитогликогену, чем один ISA1 [240]. Таким образом, как на каталитические свойства, так и на стабильность ISA1, по-видимому, влияет ISA2, и как гомомерные, так и гетеромерные ISA могут потребоваться для оптимального синтеза амилопектина, по крайней мере, в некоторых условиях.

Роль комплексообразования и фосфорилирования ферментов биосинтеза крахмала

За последнее десятилетие появилось все больше доказательств образования комплексов между ферментами биосинтеза крахмала и фосфорилирования этих ферментов.Недавно были идентифицированы два дополнительных комплекса, которые отличаются друг от друга, поскольку они включают белки без очевидных каталитических функций (см. Раздел «Связывающие крахмал белки и другие новые белки»). В раннем исследовании, посвященном этой теме, коиммунопреципитация показала, что BEIIb взаимодействует с BEI и фосфорилазой крахмала в эндосперме пшеницы [123]. Обработка белкового экстракта щелочной фосфатазой устраняла эти взаимодействия, тогда как инкубация с АТФ имела противоположный эффект.Таким образом, предполагается, что фосфорилирование является предпосылкой для образования комплекса, что согласуется с наблюдением, что все БЭ пшеницы могут фосфорилироваться [123]. Позже эксклюзионная хроматография (SEC) экстрактов амилопластов эндосперма кукурузы показала, что SSII, SSIII, BEIIa, BEIIb встречаются в различной степени как немономерные формы. Тесты на парное взаимодействие с помощью иммунопреципитации, аффинной очистки и двугибридного дрожжевого теста позволили предположить, что фосфорилированный комплекс SSIII, SSII, BEIIa, BEIIb (и, возможно, SSI) и второй аналогичный комплекс без SSIII [73, 74].Между тем, Tetlow с соавторами сообщили о других зависимых от фосфорилирования комплексах в эндосперме пшеницы, в том числе о комплексе между SSI, SSII и BEIIa или BEIIb [124]. Это наблюдение было также основано на попарной коиммунопреципитации, аналогичных профилях элюирования, полученных с использованием SEC, и последующем вестерн-блоттинге поперечно-сшитых фракций.

Ассоциация SSI, SSII и БЭ класса II, по-видимому, сохраняется, по крайней мере, в эндосперме злаков, что подтверждается также у кукурузы [125], ячменя [126] и риса [127].В семенах пшеницы и ячменя, где BEIIa и BEIIb выполняют повторяющиеся функции, этот комплекс содержит любой из них, а в ячмене, возможно, оба [124, 126]. В эндосперме кукурузы и риса, где BEIIb является доминирующим BE, BEIIa обычно не связан с комплексом [125, 127].

Знание о существовании этих белковых комплексов неизбежно поднимает вопрос об их значении. В частности, важно понимать, чем функции ферментов в комплексе различаются по сравнению с функциями их мономерных форм.Эта информация сильно повлияет на интерпретацию мутантных фенотипов и, следовательно, на наше понимание роли отдельных ферментов: если отсутствие одного фермента отменяет образование всего комплекса и изменяет активность оставшихся теперь исключительно мономерных или частично комплексных ферментов, результирующий фенотип будет результатом не только отсутствия активности фермента, но также и изменения биосинтетического аппарата в целом.

В ssII мутантов SSI и взаимодействующие BEII (s) постоянно появляются меньше во фракции, связанной с гранулами [150, 151, 244].Это также наблюдалось в связывающем крахмал мутанте SSII [245]. Более того, в отсутствие BEIIb у кукурузы в эндосперме образуется модифицированный комплекс: SSI и SSII теперь взаимодействуют с BEI, BEIIa и фосфорилазой [125, 246]. Сходным образом репрессированные BEIIa или BEIIb заменялись на BEI и фосфорилазу в комплексе в ячмене [126]. В обоих случаях замена белка отражалась на профиле белков, связанных с гранулами: новые комплексные ферменты становились связанными с гранулами вместе со своими комплексными партнерами и GBSS [125, 126].Это говорит о том, что белки в комплексе обладают более высоким сродством к крахмалу. Тем не менее, стоит отметить, что как BEIIb, так и SSI могут связывать крахмал самостоятельно [139, 245, 246], и остается неясным, требуется ли тесная ассоциация или даже захват для оптимальной активности.

Потенциальная биологическая функция для образования комплекса может заключаться в передаче субстратов от одного фермента к другому — вновь созданная ветвь, возникающая в результате действия BE, может быть непосредственно удлинена сначала SSI, а затем SSII, тем самым повышая общую эффективность процесса.Также возможно, что комплекс придает ферментативную специфичность; например, стерические ограничения всего комплекса могут определять длину цепи, которая передается ВЕ, или где именно размещается новая ветвь. Тетлоу и Эмес [115] далее предположили, что образование комплексов может регулировать активность ферментов аллостерически и / или может защищать растущий глюкан от разложения ферментов. Тем не менее, ни одна из этих гипотез еще не проверена.

Сходным образом роль фосфорилирования BE и некоторых SS [28] остается загадочной.Помимо стимулирования образования комплексов, фосфорилирование также увеличивает активность стромальных BEIIa и BEIIb у пшеницы [123]. Мутация консервативных сайтов фосфорилирования BEIIb кукурузы на серин резко снижает активность рекомбинантного белка in vitro [247]. Поскольку эта активация происходит в отсутствие его партнеров по взаимодействию, это показывает, что фосфорилирование не обязательно увеличивает активность BEIIb за счет образования комплексов. Авторы также представили доказательства участия Ca ²⁺ -зависимых протеинкиназ в фосфорилировании BEIIb.

Очевидно, что в будущем будет большая потребность в детальном биохимическом и структурном анализе этих белковых комплексов. В частности, создание мутантных белков, которые все еще активны, но неспособны взаимодействовать со своими ферментативными партнерами, могло бы помочь в установлении важности комплексов.

Дополнительные факторы с предполагаемым влиянием на синтез крахмала

Обратимое фосфорилирование глюканов

Обратимое фосфорилирование крахмала лучше всего охарактеризовано у Arabidopsis, где оно имеет решающее значение для эффективного разложения.Считается, что фосфорилирование глюкозильных единиц в положениях C6 или C3 (осуществляемое глюканом, водной дикиназой, GWD или фосфоглюканом, водной дикиназой, PWD, соответственно [248, 249]) разрушает и дестабилизирует спиральные структуры, образованные цепями глюкана, делая их доступными для разрушающих ферментов, в частности β-амилаз [250]. Поскольку экзо-действующие β-амилазы не могут разрушать прошлые фосфатные группы, их необходимо гидролизовать одновременно с помощью фосфоглюканфосфатаз SEX4 (гидролизуется по C6 и C3 [251]) и Like-SEX4 2 (LSF2; гидролизуется по C3 [252], недавно рассмотрено в [253]).

Однако фосфорилирование глюкана не ограничивается темным периодом. Крахмал из листьев арабидопсиса, полученный в течение одного фотопериода, фосфорилируется по C6 и C3, что свидетельствует о том, что и GWD, и PWD активны в течение дня. Более того, мутанты lsf2 имеют повышенные уровни фосфорилирования C3 в конце дня, хотя эти мутанты почти полностью разрушают свой крахмал в ночное время. Это говорит о том, что фосфатные группы, введенные в течение дня, обычно также удаляются LSF2 [252].Кроме того, было показано, что количество C6-связанного фосфата в крахмале Arabidopsis в конце дня является переменным и положительно коррелирует с фотопериодом [254]. Инкубация дисков клубней картофеля с глюкозой и радиоактивно меченным ортофосфатом привела к образованию радиоактивно меченного фосфата в крахмале, что также указывает на то, что фосфат включается во время чистого синтеза запасного крахмала [255].

Актуальность фосфорилирования во время синтеза еще не ясна. Крахмалы из мутантов Arabidopsis gwd , которые практически не содержат фосфатов, имеют нормальную внутреннюю структуру, но отличаются своей зернистой поверхностью, которая нерегулярна и имеет более короткие цепи [256].Однако эти различия могут быть вторичными эффектами неполной деградации крахмала в течение ночи и последующего синтеза глюканов поверх этих измененных гранулированных поверхностей. Мутанты Arabidopsis gwd также имеют лишь незначительный чистый синтез крахмала в течение дня. Это может означать, что недостаток GWD в целом подавляет синтез крахмала [257]. Однако, подавляя GWD в течение продолжительной ночи, Skeffington и его коллеги получили растения без оставшегося крахмала и GWD, и они синтезировали количества крахмала дикого типа на следующий день [257].Таким образом, маловероятно, что GWD требуется непосредственно в процессе синтеза крахмала. Скорее, фосфорилирование глюканов GWD для эффективной деградации глюкана в течение ночи может иметь важное значение для последующего синтеза крахмала: либо напрямую путем предоставления надлежащего исходного материала, либо косвенно, влияя на распределение углерода (мутанты gwd и голодают в течение ночи, что может повлиять на использование фотоассимилируется на следующий день).

α-Глюканфосфорилаза — фосфолиз или синтез?

α-Глюканфосфорилаза (EC 2.4.1.1) катализирует обратимую реакцию (α-1,4-связанная глюкоза) _n + глюкозо-1-фосфат ⟷ (α-1,4-связанная глюкоза) _{n +1} + ортофосфат. У высших растений есть два класса фосфорилазы: пластидиальный и цитозольный. Пластидный класс, названный Pho1, PhoL (из-за его низкого сродства к гликогену) или PHS1, несет вставку из 78 аминокислот рядом с сайтом связывания глюкана и показывает самое высокое сродство к линейным глюканам, особенно мальтоолигосахаридам.Напротив, цитозольный класс, названный Pho2, PhoH или PHS2, предпочитает разветвленные субстраты, такие как гликоген [258, 259].

Функция Pho1 неоднозначна до такой степени, что даже не ясно, действует ли он синтетическим или фосфоролитическим (т. Е. Разлагающим) образом in vivo. Пластидная концентрация ортофосфата обычно превышает концентрацию глюкозо-1-фосфатного многообразия [260], что способствует фосфолизу in vivo. Тем не менее было показано, что рис Pho1 катализирует удлинение цепи, а также ее укорочение при сопоставимых концентрациях in vitro [261, 262].Рисовые мутанты Pho1 продуцируют крахмал эндосперма с немного более короткими цепями, более низкой температурой желатинизации и измененной формой гранул, хотя этот фенотип не был полностью пенетрантным [261]. Дополнительный фенотип наблюдался, когда большинство зерен сморщивалось и содержало мало крахмала, когда растения выращивали при более низких температурах (20 ° C) [261]. Было высказано предположение, что в этих условиях Pho1 может работать в биосинтетическом направлении, помогая инициировать синтез крахмала путем синтеза мальто-олигосахаридных праймеров для SS, что объясняет условную потерю крахмала у мутантов.Однако репрессия Pho1 в ячмене [263] не оказывала очевидного эффекта на инициацию крахмальных гранул, хотя количество гранул не оценивалось.

Тем не менее, экспрессия генов и / или ферментативная активность Pho1 коррелирует с таковой из известных генов биосинтеза крахмала в клубнях картофеля [264] и эндоспермах кукурузы, пшеницы и ячменя [263, 265, 266], что согласуется с ролью в биосинтезе. Действуя в фосфоролитическом направлении, Pho1 может способствовать разложению мальтоолигосахаридов, созданных во время обрезки глюкана изоамилазой, с образованием глюкозо-1-фосфата для последующего обратного превращения в АДФ-глюкозу [267].Учитывая, что Pho1 взаимодействует с BEIIb и BEI в амилопластах пшеницы и кукурузы дикого типа [123, 268] и с SSI, SSIIa и BEI у мутантов beII кукурузы и ячменя [125, 126], Pho1 также может действовать. косвенно, изменяя их ферментативную активность или непосредственно на их продуктах.

В C. reinhardtii , который отличается от сосудистых растений наличием двух пластидных изоформ, PhoA и PhoB, потеря PhoB привела к снижению содержания крахмала. Оставшийся крахмал, кроме того, имел более высокое относительное содержание амилозы и структурные модификации [267].Тем не менее, этот фенотип был ограничен условиями азотного голодания, когда поток в крахмал наиболее высок. PhoB также больше похож на цитозольный, чем на пластидный класс сосудистых растений, поскольку он лишен типичной вставки последовательности и имеет низкое сродство к мальто-олигосахаридам [267].

Также было предположение, что PhoI может участвовать в разложении крахмала. Однако не было отмечено значительного влияния на содержание крахмала в листьях при репрессии листовой изоформы Pho1 у картофеля [269] или у мутанта pho1 Arabidopsis [270–272].Хотя эти отчеты указывают на существенную роль во время деградации преходящего крахмала, локальное накопление крахмала наблюдалось вокруг поражений листьев, что привело к предположениям о специфической роли фосфорилазы в обеспечении респираторных субстратов во время стрессовых реакций [270, 273]. Совсем недавно генетические доказательства участия Arabidopsis Pho1 в деградации крахмала были получены на основе дефицита Pho1 на фоне мутантов ssIV и мутантов с нарушенным метаболизмом мальтозы [271, 272].

Белки, связывающие крахмал, и другие новые белки

В последние годы было идентифицировано несколько новых белков, которые влияют на структуру и / или количество крахмала. В некоторых случаях воздействие на крахмал может быть косвенным, в то время как в других белки могут быть частью еще не открытого аспекта процесса биосинтеза крахмала. В любом случае анализ лежащих в основе механизмов может дать новое понимание аспектов биосинтеза крахмала, которые выходят за рамки основного ферментного аппарата, таких как регуляция синтеза крахмала или влияние пластидного окружения на образование и морфологию гранул.

Peng и его коллеги описали рисовый Floury Endosperm6 (FLO6), пластидный белок с CBM48 и способностью связывать крахмал [274]. Зерна, дефицитные по FLO6, откладывают различные гранулы крахмала с изменениями морфологии и структуры амилопектина [274]. Интересно, что FLO6 физически взаимодействовал с ISA1, который сам по себе не связывался с крахмалом. Было высказано предположение, что FLO6 обеспечивает связывание крахмала с ISA1 и что фенотип flo6 является результатом измененной функции ISA1.Это важная гипотеза для проверки, учитывая важность, приписываемую ISA в сокращении образующегося амилопектина для облегчения его кристаллизации.

Другой пластидный белок, содержащий CBM48, Protein Targeting To Starch (PTST), был описан в Arabidopsis [95, 104]. В дополнение к CBM, PTST содержит предсказанные мотивы coiled-coil. Было показано, что PTST связывается с GBSS посредством взаимодействия через мотив спиральной спирали на GBSS и что это взаимодействие позволяет GBSS связываться с гранулами крахмала: потеря PTST приводит к потере GBSS из гранул in vivo и потере синтеза амилозы [ 95].В дополнение к биотехнологической значимости (как высокое, так и низкое содержание амилозы являются желанными характеристиками крахмала), FLO6 и PTST, таким образом, представляют собой захватывающие примеры неферментативных белков, которые, по-видимому, играют важную роль в нацеливании или модуляции активности ферментов биосинтеза крахмала.

Другой класс неферментативных белков совсем недавно был обнаружен у арабидопсиса. Обозначенный Early Starvation1 (EST1), этот связывающий пластидный крахмал белок был идентифицирован, потому что у мутантов, у которых он отсутствует, обнаруживается преждевременное истощение переходного крахмала ночью [275].Это, по-видимому, происходит из-за изменения морфологии крахмальных гранул, что приводит к несоответствующей деградации крахмала в дневное время и ускоренной неконтролируемой деградации крахмала в ночное время. Напротив, у растений, сверхэкспрессирующих EST1, развился фенотип с избытком крахмала, указывающий на ингибированную деградацию крахмала. Хотя точная молекулярная функция белка неизвестна, генетические данные свидетельствуют против прямого ингибирования деградирующих ферментов EST1. Предполагается, что EST1 может каким-то образом способствовать правильному выравниванию молекул глюкана в гранулированном матриксе — процесс, который до сих пор считался спонтанным.Интересно, что гомолог EST1, подобный EST1 (LEST), по-видимому, выполняет противоположную роль: в то время как , чтобы мутанты не обладали фенотипом дикого типа, сверхэкспрессия приводит к фенотипу с низким содержанием крахмала, аналогичному таковому у мутантов est1 [ 275].

Изменения морфологии крахмальных гранул в эндоспермах злаков также были связаны с нарушениями других клеточных процессов, включая стресс ER [276], нарушение переноса запасных белков [277] и измененный липидный состав мембран пластид [166].Эти наблюдения подчеркивают зависимость образования гранул крахмала от общей эффективности функционирования пластид и клеток. Локализованные в пластидах некондиционное крахмальное зерно4 (SSG4) также может попадать в эту категорию. Мутанты, лишенные этого белка, имеют увеличенные зерна крахмала и пластиды, потенциально возникающие из-за дисфункции во время развития пластид [278, 279]. Недавно сообщалось, что потеря другого стромального белка, Floury Endosperm7 (FLO7), вызывает структурные и морфологические изменения в крахмале.Этот фенотип был ограничен периферией семян риса, где также преимущественно экспрессируется FLO7, но функция FLO7 остается неизвестной [280].

Наконец, другие исследования начали раскрывать регуляторные факторы, которые, по-видимому, влияют на структуру и / или содержание крахмала, контролируя экспрессию генов биосинтеза крахмала. Например, факторы транскрипции Os, bZIP58 и Rice Starch Regulator1 (RSR1), как было показано, регулируют экспрессию ряда генов биосинтеза крахмала в зернах риса, тем самым влияя на структуру крахмала и упаковку гранул [281, 282].Сходным образом Floury Endosperm2 (FLO2), ядерный белок с мотивом TPR, влияет на морфологию крахмальных гранул и экспрессию генов биосинтеза крахмала, предположительно за счет взаимодействия с факторами транскрипции [283].

Этот разнообразный набор недавно идентифицированных белков служит иллюстрацией того, что еще многое предстоит понять о биосинтезе крахмала и клеточном контексте, в котором он происходит. Стоит отметить, что большинство описанных выше белков эволюционно законсервированы у высших растений, и межвидовой анализ будет важным аспектом дальнейших исследований.

Крахмал

Крахмал — это сложный полисахарид, состоящий из большого количества единиц глюкозы, соединенных гликозидными связями. Это белый порошок без вкуса и запаха. Имеет переменную молярную массу. Не растворяется в спирте и холодной воде. Его химическая формула: (C ₆ H ₁₀ O ₅ ) _n . Два типа молекул содержат чистый крахмал: амилоза и амилопектин .И амилоза, и амилопектин представляют собой полисахариды, состоящие из остатков глюкозы. Они различаются по структуре: амилоза — это , линейная цепь молекул глюкозы, , связанных α- (1,4) гликозидными связями, тогда как амилопектин — это , разветвленная цепь молекул глюкозы, , линейно связанных с α- (1,4) гликозидными связями. и α- (1,6) связи с интервалом от 24 до 30 субъединиц глюкозы. Поскольку крахмал представляет собой полисахарид, состоящий в основном из D-глюкозы, он принадлежит к группе α-глюканов .

Амилопектин более растворим в воде и легче переваривается, чем амилоза. Его растворимость обусловлена ​​множеством конечных точек, которые могут образовывать водородные связи с водой. Обычно крахмал содержит 75-80% амилопектина и 20-25% амилозы по весу.

Синтез обезвоживания

Химический процесс соединения моносахаридных единиц называется синтез обезвоживания , поскольку он приводит к выделению воды в качестве побочного продукта. Крахмал производится путем дегидратационного синтеза.Растения хранят глюкозу, которая не используется в качестве крахмала. Сначала глюкоза фосфорилируется до глюкозо-1-фосфат . Гранулы крахмала хранятся внутри амилопластов , расположенных внутри клеток различных органов растений. Гранулы крахмала могут быть найдены в плодах , семенах , клубнях и корневищах . Маргаритки, подсолнухи и топинамбур являются примерами растений, которые хранят инулин (фруктан) вместо крахмала.

Разложение

У растений разложение крахмала происходит естественным образом в ночное время.Фермент глюкан-вода-дикиназа фосфорилирует крахмал, особенно по C-6 одного из остатков глюкозы. Затем другой фермент (фосфоглюкан-водная дикиназа , ) фосфорилирует остаток глюкозы по C-3. После фосфорилирования разлагающие ферменты теперь могут воздействовать на крахмал, высвобождая простые сахара. Например, бета-амилаза высвобождает два остатка глюкозы, как мальтоза . Другой фермент разложения — это фермент диспропорционирования-1 , который в конце процесса разложения высвобождает молекулу глюкозы.Разложение крахмала приводит в основном к мальтозе и меньшему количеству глюкозы. Эти простые сахара затем будут перемещаться из пластиды в цитозоль с помощью транспортеров: транспортер мальтозы, для мальтозы и пластидный транслокатор глюкозы, для глюкозы. Позже они могут быть использованы в качестве субстрата для биосинтеза сахарозы, которая важна в митохондриальном пути окислительной пентозы , который генерирует АТФ в ночное время. (Ссылка 2)

Гидролиз

Гидролиз — это процесс превращения полисахарида, такого как крахмал, в простые сахарные компоненты.Процесс превращения полисахаридов в моносахариды, в частности, называется осахариванием . У человека сложные углеводы, такие как крахмал, перевариваются посредством ряда ферментативных реакций. Эти ферменты представляют собой амилазы слюны , амилазы поджелудочной железы и мальтазы . Амилаза слюны воздействует на крахмал и расщепляет его до мальтозы . Когда частично переваренные углеводы достигают тонкой кишки, поджелудочная железа выделяет сок поджелудочной железы, который включает амилазу поджелудочной железы .Этот фермент действует на частично переваренные углеводы, расщепляя их на простые сахара. Кайма тонкой кишки высвобождает пищеварительные ферменты, такие как изомальтаза , мальтаза , сахараза и лактаза . Изомальтаза переваривает полисахариды по альфа-1-6 связям и превращает альфа-предельный декстрин в мальтозу. Мальтаза расщепляет мальтозу (дисахарид) на две единицы глюкозы. Сахараза и лактаза расщепляют сахарозу и лактозу на моносахаридные составляющие соответственно.Эпителиальные клетки ( энтероцитов, ) щеточной каймы тонкой кишки поглощают моносахариды, а затем высвобождают их в капилляры. Затем простые сахара переносятся из кровотока в клетки других тканей, особенно в печень. Глюкоза в крови может использоваться организмом для производства АТФ. В противном случае он транспортируется в печень вместе с галактозой и фруктозой (которые в значительной степени превращаются в глюкозу) для хранения в виде гликогена.

Резистентный крахмал

Резистентный крахмал — это форма крахмала, которая противостоит перевариванию в тонком кишечнике человека.Это также пищевых волокон, . Вместо этого он метаболизируется в толстом кишечнике микробиотой толстой кишки. Микробы в толстой кишке ферментируют его и производят побочные продукты метаболизма, такие как газы и короткоцепочечные жирные кислоты. В частности, короткоцепочечные жирные кислоты абсорбируются и приносят пользу человеческому организму. Ферментация устойчивого крахмала также способствует росту полезных бактерий.

Растительный крахмал по сравнению с животным крахмалом

Животный крахмал не является крахмалом как таковой .Он относится к компоненту гликогена животного из-за сходства в структуре и составе амилопектина. В то время как растения хранят избыток глюкозы в форме крахмала, животные также хранят это в форме гликогена . Гликоген — это разветвленный полимер глюкозы, который в основном вырабатывается в клетках печени и мышц и функционирует как вторичное долгосрочное хранилище энергии в клетках животных. Как и крахмал, гликоген — это сложный углевод, который в первую очередь служит запасным углеводом.Разница между амилопектином в растениях и амилопектином у животных состоит в том, что последний имеет более обширное разветвление на каждые 8–12 единиц глюкозы.

Биологическое значение

Все семена и клубни растений содержат крахмал, который преимущественно присутствует в виде амилозы и амилопектина. Растения используют крахмал как способ хранения избытка глюкозы и, таким образом, также используют крахмал в качестве пищи посредством митохондриального окислительного фосфорилирования в ночное время или когда фотосинтез маловероятен. Растения накапливают избыток крахмала в амилопластах, которые представляют собой лейкопласты, которые функционируют в основном для хранения гранул крахмала за счет полимеризации глюкозы и преобразования этих запасов обратно в более простые сахара (например,грамм. мальтоза и глюкоза), особенно при отсутствии света. Хлоропласты, пигментированные органеллы, участвующие в основном в фотосинтезе, также способны накапливать крахмал.

Животные не хранят избыток глюкозы в виде крахмала; они хранят их в виде гликогена. Однако некоторые животные питаются крахмалосодержащей пищей.
Диетический крахмал присутствует во многих основных продуктах питания, таких как кукуруза , рис , пшеница , картофель , маниока , ячмень , рожь , таро , ямс , и т. Д. .Он также присутствует в различных пищевых продуктах, таких как злаков , лапша , блины , хлеб , макароны , и т. Д. . Крахмал обеспечивает около 4,2 килокалорий на грамм. У человека крахмал может служить основным источником глюкозы. Глюкоза важна, так как она участвует в общем метаболизме, например гликолиз (для синтеза энергии), гликогенез (для синтеза гликогена), пентозофосфатный путь (для пентоз и синтеза НАДФН для использования в синтезе нуклеиновых кислот и синтезе липидов, соответственно).
Крахмал имеет множество коммерческих применений, например, в производстве бумаги, пищевых продуктов, при производстве коммерческого виноградного сахара, для придания жесткости белью в прачечных, для изготовления пасты, в полиграфической промышленности, производстве водорода и т. Д.

Риск для здоровья

Слишком много крахмала в рационе связано с кариесом зубов , ожирением и сахарным диабетом . Крахмал (особенно приготовленный и содержащийся в обработанных пищевых продуктах) может вызывать скачки уровня глюкозы в крови после еды.Таким образом, рекомендуется умеренное потребление крахмала. Людям с глютеновой болезнью и врожденным дефицитом сахаразы-изомальтазы может потребоваться избегать крахмалистых продуктов. (Ссылка 3)

Этимология

• Староанглийский stearc («резкий, сильный, грубый»)

Химическая формула

Связанные термины

Сравнить

См. Также

Ссылки:

1. Каша была съели 100000 лет назад.(2009, 18 декабря). Получено с telegraph.co.uk/news/uknews/6834609/Porridge-was-eaten-100000-years-ago.html Ссылка
2. Соавторы Википедии. (2019, 25 февраля). Крахмал. Получено с en.wikipedia.org/wiki/Starch#Energy-store-of-plants Ссылка
3. Крахмал: продукты питания, пищеварение, гликемический индекс. (2016, 4 июня). Получено с сайта nutreview.com/carbs/polysaccharides-starch.html Ссылка

© Biology Online. Контент предоставлен и модерируется Biology Online Editors.

В крошечном мире крахмальных зерен больше значит лучше

Изображение крахмальных зерен в поляризованном микроскопе.Фото: Крис Томас, Milton Contact.

Майкл Мозди